一、核心定義??
??共聚焦顯微鏡??是一種利用點(diǎn)照明和空間針孔技術(shù)來(lái)消除焦外雜散光，從而獲取高分辨率、高對(duì)比度光學(xué)切片的先進(jìn)成像技術(shù)。它是進(jìn)行三維熒光成像和活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)的關(guān)鍵工具。
??二、成像原理??
??1.點(diǎn)掃描激發(fā)??
高相干性激光束經(jīng)??聲光調(diào)制器??精確調(diào)諧后，通過(guò)??物鏡聚焦??至樣品內(nèi)部形成??亞微米級(jí)光斑。該光斑在XYZ三軸壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行??光柵式逐點(diǎn)掃描??，每點(diǎn)激發(fā)樣品產(chǎn)生特定波長(zhǎng)熒光信號(hào)。
2??.針孔空間濾波??
發(fā)射熒光通過(guò)??共軛針孔陣列濾除??焦外雜散光??，僅保留焦平面信號(hào)被??高靈敏度光電倍增管捕獲。通過(guò)同步移動(dòng)針孔與掃描光斑的位置，實(shí)現(xiàn)??光學(xué)層切??并構(gòu)建無(wú)背景干擾的三維圖像。
3??.雙光子深度成像??
在紅外激發(fā)模式下，??雙光子非線性吸收效應(yīng)??使熒光激發(fā)僅發(fā)生在焦點(diǎn)處，實(shí)現(xiàn)??深層組織穿透并顯著降低光漂白損傷，適用于腦切片、胚胎發(fā)育等厚樣本觀測(cè)。
?? 三、主要優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)
1.更高的軸向(Z軸)分辨率：能夠顯著減少焦外模糊，光學(xué)切片能力更強(qiáng)。其Z軸分辨率約為0.5-0.8 µm，遠(yuǎn)優(yōu)于寬場(chǎng)顯微鏡。
2.出色的對(duì)比度：針孔有效阻擋了雜散光，使得信噪比大幅提升，圖像背景極黑，目標(biāo)信號(hào)清晰。
3.光學(xué)切片能力：這是共聚焦顯微鏡強(qiáng)大的功能之一。通過(guò)精確移動(dòng)載物臺(tái)或物鏡，可以獲取樣品不同深度的一系列二維圖像。
4.三維重建：將獲取的一系列二維光學(xué)切片通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行重構(gòu)，可以得到樣品精細(xì)的三維結(jié)構(gòu)。
5.多通道成像：可以同時(shí)使用多種不同波長(zhǎng)的激光，檢測(cè)不同顏色的熒光探針，從而在同一個(gè)樣品上觀察多種生物分子或結(jié)構(gòu)的分布及共定位情況。
?? 四、操作流程??
1??.樣品制備??
固定樣品需經(jīng)??抗淬滅封片劑??處理；活體樣本使用??低光毒性染料??(如Höechst 33342)標(biāo)記，裝載于??玻底培養(yǎng)皿??(厚度#1.5)以確保物鏡理想工作距離。
??2.系統(tǒng)校準(zhǔn)??
??激光合束??：調(diào)節(jié)各通道激光光路重合度(誤差<1像素)
??針孔對(duì)準(zhǔn)??：利用0.1μm熒光微球校準(zhǔn)針孔共軛位置
??Z軸基準(zhǔn)??：通過(guò)反射鏡確定物鏡零焦平面
??3.圖像采集??
??參數(shù)設(shè)置??：根據(jù)熒光素特性選擇激發(fā)波長(zhǎng)與探測(cè)器增益
??層掃模式??：設(shè)定Z軸起始位置、步距與層數(shù)
??時(shí)間序列??：?jiǎn)?dòng)定時(shí)掃描追蹤動(dòng)態(tài)過(guò)程
??4.數(shù)據(jù)處理??
??三維重建??：通過(guò)反卷積算法提升分辨率
??動(dòng)態(tài)分析??：使用TrackMate插件量化顆粒運(yùn)動(dòng)軌跡與速率
??五、共聚焦顯微鏡的典型應(yīng)用場(chǎng)景??
??神經(jīng)科學(xué)??：觀測(cè)小鼠海馬體神經(jīng)元樹(shù)突棘在長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)過(guò)程中的形態(tài)變化
??癌癥研究??：追蹤腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物載體(如脂質(zhì)體)的溶酶體逃逸路徑
??材料表征??：分析鈣鈦礦太陽(yáng)能電池晶界處的載流子復(fù)合動(dòng)力學(xué)(FLIM模式)
??微生物學(xué)??：記錄沙門(mén)氏菌侵襲宿主細(xì)胞的膜融合事件(時(shí)間分辨率500ms)
